質(zhì)譜儀的校準對于精確的 m/z 測量至關(guān)重要。校準的定義是“將已知精度的測量標準或儀器與另一標準或儀器進行比較，通過調(diào)整消除偏差”。本文中的校準一詞用于表示質(zhì)量軸校準。其他校準（如電源電壓）不在本章討論范圍之內(nèi)。質(zhì)量軸校準需要在整個質(zhì)量范圍內(nèi)均勻分布一系列離子。校準完成后，可以在校準范圍內(nèi)的任何質(zhì)量范圍獲取數(shù)據(jù)。因此，在較大的質(zhì)量范圍內(nèi)進行校準是明智之舉。手動、半自動和自動校準要求在程序運行時以穩(wěn)定的速率將校準液（校準溶液）引入質(zhì)譜儀。校準溶液通過注射泵或連接到 LC 泵的注射器直接（注入）到質(zhì)譜儀中。

建議至少每三個月校準一次質(zhì)譜儀，并且大約每周檢查一次校準情況。校準的頻率取決于所需的質(zhì)量精度。例如，在對肽和蛋白質(zhì)進行精確質(zhì)量測量時，應每天校準儀器。不過，小分子定量分析所需的校準頻率較低。

校準參數(shù)

質(zhì)量分析儀應定期注入校準溶液進行校準。一般使用電噴霧離子源 (ESI)。該溶液產(chǎn)生的離子（已知精確質(zhì)量）應涵蓋整個儀器的質(zhì)量范圍，或至少涵蓋將用于后續(xù)分析的質(zhì)量范圍。

其中校準所涉及的參數(shù)稱為校準參數(shù)。是指：其值不隨實驗類型而變化的儀器參數(shù)，例如峰寬、峰形、質(zhì)量分布以及分辨率與靈敏度等。

峰寬取決于質(zhì)量分辨率。在大多數(shù)小分子定性/定量應用中，1 個質(zhì)量單位（即1 Da)的分辨率足以區(qū)分離子。單位分辨率的典型定義是:半峰高處的峰寬約為 0.6 至 0.8 質(zhì)量單位。典型臺式 LC-MS 的離子輪廓掃描帶寬約為 1 個質(zhì)量單位。

峰形和輪廓掃描。如圖 2 所示，在典型的臺式 LC-MS 中，豐度測量是以 0.10 m/z 的增量進行采集。當這些數(shù)據(jù)顯示在質(zhì)譜中時，可顯示一條單線。高度和位置由輪廓掃描得出。

質(zhì)量分配。使用特定的質(zhì)譜校準物進行。校準物應是特性良好的參考物質(zhì)。這些物質(zhì)的認證和處理應記錄在案。LC-MS 定性分析始終使用參比物質(zhì)，而定量分析則結(jié)合使用參比物質(zhì)和實際分析物標準品作為校準物。

分辨率與靈敏度。質(zhì)量分辨率是離子強度和峰寬之間的折衷。一般來說，分辨率越高，離子強度越低。

校準方法

對于市場上最新的 LC-MS 來說，軟件包中包含了一個自動程序，用于在 ESI 模式下進行調(diào)整和校準。不過，較舊的儀器和/或非常特殊的應用仍需要手動或半自動程序來優(yōu)化影響離子檢測的參數(shù)。在 LC-MS 儀器中，質(zhì)譜儀的校準分為三個步驟：

離子源和傳輸優(yōu)化

質(zhì)譜校準

微調(diào)（最大限度地檢測一個或多個特定離子）。

離子源和傳輸優(yōu)化。在這一步驟中，以 5 μL/min 左右的穩(wěn)定速率注入校準溶液，持續(xù)數(shù)分鐘，從而在 ESI 模式下對質(zhì)譜儀的一個或多個特定離子進行大致調(diào)整。引入校準溶液化合物的最佳方法是使用大容量萊茵進樣環(huán)（50 或 100 μL）或注射泵（如漢密爾頓注射泵）：使用大容量注射回路時，溶劑輸送系統(tǒng)應設置為以5μL/min 左右的速度將 50 : 50 的乙腈/水或 50 : 50 的甲醇/水通過注射器注入離子源。注射 50 μL 校準溶液將持續(xù)至少 10 分鐘。使用輸液泵時，應將校準溶液注入注射泵，然后用熔融石英管或 peek 管連接至 ESI 噴針。

選擇用于優(yōu)化的離子應位于校準范圍的中間或特定的相關(guān)區(qū)域（例如，咖啡因的 m/z = 195 或 PPG 校準溶液的 m/z = 906.7）。在使用自動調(diào)整程序來證明進入質(zhì)譜儀的離子傳輸達到最佳狀態(tài)之前，應手動調(diào)整 ESI 源噴霧器，以建立進入質(zhì)譜儀的穩(wěn)定離子噴霧，并確保檢測到足夠的離子來校準質(zhì)譜儀。

調(diào)整程度因型號而異，并取決于源的幾何形狀。一般來說，噴霧偏離入口軸線的離子源（如正交噴霧和 Z 向噴霧）需要的調(diào)整較少。對于同軸噴霧源，為避免污染儀器光學元件，必須檢查噴霧源是否直接噴射到儀器孔口。軸上離子源通常有一個側(cè)窗，可以很好地觀察噴射軌跡。在這兩種情況下，噴霧器都應始終小幅度移動，直到達到所關(guān)注離子的最高信噪比的最佳位置。離子源參數(shù)（如霧化器氣體、透鏡電壓）可自動、半自動或手動優(yōu)化。

質(zhì)譜校準。第二步，使用校準溶液校準 ESI 模式下的質(zhì)譜儀。所有質(zhì)量分析儀都必須校準。例如，三重四極桿質(zhì)譜儀 (QQQ) 的 Q1 和 Q3 都要進行校準。以下是校準過程：

01

獲取校準溶液的質(zhì)譜圖（校準文件），并與存儲在參考文件中的校準溶液質(zhì)譜峰預期質(zhì)量表進行比對。

02

將參照文件中的每個質(zhì)譜峰與校準文件中的相應質(zhì)譜峰進行匹配。

03

校準文件中相應的匹配質(zhì)譜峰即為校準點。

04

通過校準點擬合校準曲線。

05

計算每個校準點與曲線的垂直距離。該距離代表校準后的殘差。同時計算殘差的標準偏差。這個數(shù)字是校準精度的最佳單一指標。

06

同時計算殘差的標準偏差。這個數(shù)字是校準精度的最佳單一指標。

自動校準

在開始自動校準之前，需要設置一些峰值匹配參數(shù)。這些參數(shù)決定了獲取的數(shù)據(jù)必須在哪個范圍內(nèi)，軟件才能識別校準質(zhì)量并成功校準。這些參數(shù)包括：

01

質(zhì)譜峰搜索范圍。這是校準軟件用于搜索最強質(zhì)譜峰的窗口。增大該窗口會增加質(zhì)譜峰匹配錯誤的幾率。必須確保在質(zhì)譜峰搜索范圍內(nèi)找到正確的質(zhì)譜峰；否則，校準可能會出現(xiàn)偏差。如果定位到不正確的峰，則應調(diào)整搜索質(zhì)譜峰范圍，以便只定位到正確的離子。

02

質(zhì)譜峰閾值。校準程序中將不使用所獲質(zhì)譜中低于強度閾值（通常以質(zhì)譜中最強峰的百分比來衡量）的所有峰。

03

質(zhì)譜峰最大標準偏差或預測質(zhì)量與實際質(zhì)量之間的最大差值。在校準過程中，每對匹配峰都會測量獲取的校準文件中的測量質(zhì)量與參考文件中的真實質(zhì)量之間的差值。如果該值超過設定值，校準將失敗。降低標準偏差值可獲得更嚴格的限制，而增加標準偏差則意味著更容易滿足要求，但這可能會導致質(zhì)譜峰匹配不正確。

04

峰寬。這是一個用于設置分辨率的指標，通常規(guī)定為最大強度的 50%。

如果獲取的質(zhì)譜圖與參考質(zhì)譜圖相似，且所有預期質(zhì)譜峰都通過了上述標準，則校準可以接受。如果儀器以前從未校準過或以前的校準文件丟失，則必須使用更詳細的校準程序。該校準程序要求從最低質(zhì)量離子開始定位已知質(zhì)譜峰。找到質(zhì)譜峰后，將為離子的精確質(zhì)量分配一個數(shù)模轉(zhuǎn)換值。

一旦對儀器進行了全面校準，下次使用儀器時并不一定需要重復全面校準過程�？梢酝ㄟ^注入校準溶液并將所有質(zhì)譜峰匹配參數(shù)設置為全面校準時使用的值來執(zhí)行校準驗證，而不是全面校準。如果預測質(zhì)量和實際質(zhì)量之間的差異不大，則原始質(zhì)量校準曲線仍然有效。無論儀器型號/品牌如何，在自動校準結(jié)束時都可以獲得一份最終報告，其中顯示校準溶液的預測精確質(zhì)量、質(zhì)譜中每個峰的實際質(zhì)量、這兩個質(zhì)量之間的差值（校準精度），在許多情況下還會顯示實驗中指定的所有離子的強度和峰寬。

微調(diào)。第三步，對一個或多個特定離子的檢測進行優(yōu)化，以便在 ESI 或 APCI 模式下，利用相關(guān)分析物的標準（如果有的話）對質(zhì)譜進行調(diào)諧。可以選擇相關(guān)分析物的質(zhì)量電荷比，或者在沒有分析物標準的情況下，選擇校準溶液中最接近相關(guān)離子質(zhì)量電荷比的離子。